選擇3～5輪后，隨機挑取克隆加入96孔微量滴定板中 并誘導(dǎo)表達可溶性scFv。然后，在包被有相關(guān)抗原的96孔微量滴定板中，用ELISA分析含有可溶性scFv的細菌上清。此過程可以識別出那些結(jié)合了抗原的scFv。但即便采用上述嚴謹性選擇后，ELISA陽性克隆中僅有部分克隆的親和力比野生型高。ELISA信號強度不能很好地顯示哪個克隆具有較低的Ka值，而且更為普 遍的是它與scFv表達水平相關(guān)。因此，這就需要一種篩選ELISA陽性克隆的技術(shù)，能識別出具有較低Ka值的克隆。競爭性或抑制性ELISA就是這樣的技術(shù)。或者可以利用以下事實：koff降低一般是導(dǎo)致高親和力提高的主要動力學(xué)機制，因此通過測定解離速率就可以識別出那些親和力得到提高的抗體。因為κoff是非濃度依賴的（不同于kon，），所以無需純化抗體片段就能測定κoff，比如采用類似BIAcore的儀器進行SRP分析。我們已發(fā)現(xiàn)這是鑒別高親和力scPv的一項很有用的技術(shù)，還可以以此來評分親和力成熟了的克隆的等的。
首先，我們用ELISA識別出結(jié)合性克隆。然后，隨機挑取20一50個選擇的ELISA陽性克隆；根據(jù)κoff大小排隊比較。再選出那些κoffzui低的克隆進行亞克隆、純化，并用BIAcore進行SRP測定其Kd值。需要注意的是，在scFv情況下，解離曲線形狀可以指示出是否存在單個或多個κoff值。有多個κoff值的scFv（當以R1／R0對于作圖時，出現(xiàn)一條曲線對一條直線）是單體和二聚體的混合物，避免用于續(xù)后的研究。
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